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评估血脑屏障结构的方法

血脑屏障结构的评价主要依靠显微镜,如内皮细胞的形态、基底膜的完整性、内皮细胞结缔组织蛋白的表达等。常用的技术有电子显微镜、荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜等。
1.电镜:当血脑屏障受损时,透射电镜下可观察到一些典型的形态学和结构变化:毛细血管内皮细胞的连续性被打断,内皮细胞内的小泡数明显增加,内皮细胞间的紧密连接间隙扩大。扫描电镜(SEM)主要用于证实体外血脑屏障模型的建立。基于透射电子显微镜的高分辨率,更适合于TJ、NVU等超微结构的研究。CNS内皮细胞独特的脂类组成是BBB功能的基础。应用透射电镜观察BBB损伤时细胞囊泡的表达。
2.荧光显微镜与免疫组化技术相结合,由于组织切片和图像的主观选择和半定量分析,已成为观察血脑屏障相关蛋白表达的重要技术手段,采用高分辨率共焦z叠操作系统模拟三维视野,克服了传统荧光显微镜平面视野的局限性,定量荧光显微镜可以通过测量颅内肿瘤血管口径,间接评价恶性肿瘤BBB通透性的变化。
3.激光扫描共聚焦显微镜:共聚焦显微镜利用激光束大大提高了超微结构成像的分辨率和选择性,越来越多地用于血脑屏障的研究,但设备昂贵实用。
正常血脑屏障表现为低通透性和高阻抗。血脑屏障的功能通过检测血脑屏障的通透性、血脑屏障的跨膜阻力以及血脑屏障连接蛋白和转运体的表达来评价血脑屏障的功能。
4.染色和示踪试验:染料或放射性同位素作为示踪剂长期用于评价血脑屏障的功能,常用染料有伊文思蓝(evansblue,EB)、台盼蓝、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)、荧光标记葡聚糖等,经EB灌注染色后,显微镜下观察到血管周围的红色荧光,提示BBB损伤,并成功地应用于几种转基因小鼠和实验性疾病模型中BBB通透性的测定。
镧是一种电子密度较高的金属,通常不能通过血脑屏障。聚焦超声微泡打开血脑屏障后,镧从内皮间隙漏出,横向扩散到神经纤维。与传统示踪染料相比,镧在镜下更直观地显示血脑屏障的损伤。常用的放射性同位素标记物为[14C]α-氨基异丁酸、4-[18F]-氟安替比林等,但由于辐射污染,很少使用。
5.体外血脑屏障模型试验:体外培养脑微血管内皮细胞和建立血脑屏障模型的方法在许多文献中有报道,主要用于评价血脑屏障的功能,包括血脑屏障通透性、血管内皮细胞阻力、血脑屏障相关蛋白的表达等。FITC-葡聚糖通透性试验:用异硫氰酸酯荧光标记葡聚糖.将培养的内皮细胞悬液接种于跨孔培养池中。FITC-葡聚糖被添加到细胞的上层,这些细胞已经聚集成单层。取基底膜上的细胞标本,用荧光酶标记仪检测其荧光强度,评价血脑屏障(BBB)的通透性。
6.内源性血脑屏障损伤指数的检测:由于通透性的增加,大量细胞、纤维蛋白原、免疫球蛋白、细胞因子和BBB蛋白由于通透性的增加而进入大脑。对21例格拉斯哥评分低于8分的重型颅脑损伤患者脑脊液(脑脊液)和外周血中S-100β水平进行了监测。结果发现,15例颅内压>15 mmHg的患者,S≥10 0β明显高于颅内压<15 mmHg的患者。此外,当血脑屏障功能受损时,脑脊液中CLDN-5、OCLN、MMP-9和VEGF水平也有不同程度的升高。

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